（德國IBL：RE59161）
2、前言說明
| 注意 | 人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。 |
| 注意 | 血液采集后兩小時內(nèi)，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。 | ||
| 注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應(yīng)保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應(yīng)當離心以除去所有的微粒物質(zhì)。 | |||
| 貯存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 |
| 穩(wěn)定性 | 6h | 1個月 | |
| 可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。 | ||
| 貯存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個月 | |
| 注意 | 試劑盒所提供的試劑足夠做96孔單孔檢測或48孔雙份檢測。 |
| 注意 | 此包被板也可用于檢測腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺。 |
| 數(shù)量 | 標志 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克?。?/span> |
| 1×6×2.5ml | CAL A-F | 標準品A-F 腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml（0;8;27;82;273;819nmol/L） 去甲腎上素:0;5.0;15;50;150;500ng/mL（0;30;89;296;887;2955nmol/L） 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL（0;78;228;750;2938;14688nmol/L） 即用,內(nèi)含:腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl |
| 1×2×2.5ml | CONTROL 1+2 | 質(zhì)控品1+2 即用,含: 腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl,具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽. |
| 1×250μL | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物濃縮型（100×） 內(nèi)含：堿性磷酸酶標記的抗體，Tris緩沖液，HCl，0.01%的NaN3 |
| 4× | EXTRPLATE | 提取板（微孔板） 每板24孔，包被了硼酸親和凝膠。 |
| 2×60ml | EXTRBUF | 提取緩沖液 粉紅色，即用，內(nèi)含：0.016%的NaN3 |
| 1×1.25ml | COMT LYO | COMT凍干粉 內(nèi)含：兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（豬肝），NaN3 |
| 1×2ml | COMT ADD | COMT添加劑 內(nèi)含：人血漿，穩(wěn)定劑，0.01%硫柳汞。 |
| 1×7ml | ANTISERUM DO | 多巴胺抗血清 紫羅蘭色，即用，內(nèi)含：抗多巴胺抗體（兔），緩沖液，穩(wěn)定劑。 |
| 2×1.25ml | COENZ | 酶聯(lián)復合物 即用，內(nèi)含：S-腺苷-L-蛋白酸，穩(wěn)定劑。 |
| 1×3ml | ENZBUF | 酶緩沖液 即用，內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，穩(wěn)定劑。 |
| 4×13ml | RELEASEBUF | Release緩沖液 黃色，即用，內(nèi)含：0.1M的HCl，指示劑。 |
| 2×3ml | ACYLREAG | ?；噭?/span> 即用，內(nèi)含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。 |
| 2×50ml | WASHBUR CONC | 洗滌液濃縮型（10×） 內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，吐溫，0.2%的NaN3 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片 內(nèi)含：對硝基苯磷酸（PNPP） |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液 即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液 即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA |
| 1×20ml | HCl | HCl 即用，內(nèi)含：0.1M的HCl |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
1）移液器（10；10-100；100-1000μL）
2）軌道搖床（200-900rpm）
3）旋渦混合器
4）帶儲器的8通道移液器
5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統(tǒng)
6）酶標儀
7）雙蒸水或去離子水
8）吸水紙，取樣吸頭，計時器
9）樣品稀釋用試管。
| 注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
| 注意 | 試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。 |
| 樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
| 血漿 | 多巴胺濃度高于zui高標準品中多巴胺的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
| 尿液 | 多巴胺濃度高于zui高標準品中多巴胺的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
| 1） | 將標準品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。 |
| 2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
| 3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應(yīng)該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
| 6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL?；噭?，立即混合均勻。 |
| 9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板） |
| 10） | 快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
| 12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 14） | 每孔加入300μL Release緩沖液。 |
| 15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板） |
| 稀釋 | 成分 | | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩(wěn)定性 |
| 25ml | 洗滌液 | 225ml | 雙蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
| 60μL | 酶聯(lián)物 | 6ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1:101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生 | 18-25℃ | 5h |
| 4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
9.1 COMT酶溶液的準備
| 注意：COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時配置 |
| 在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個月。
| 注意 | 如果使用自動置換型移液器，請將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加回到提取板相應(yīng)的微孔內(nèi)。將提取板置于一斜坡位置比較適當。 |
科研用組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清可按如下建議處理：細胞培養(yǎng)上清必須根據(jù)其培養(yǎng)基及其相應(yīng)濃度進行處理：根據(jù)尿液樣品的操作說明（至少提取20ul上清液），未稀釋樣品的靈敏度大概為1.0ng/ml。如果基質(zhì)內(nèi)添加了血清（FCS），血漿（至少提取500ul上清）操作的靈敏度可以是5pg/ml。無高氯酸的組織勻漿可用做勻漿樣品，具體信息請咨詢IBL漢堡公司。
| 1 | 在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。 |
| 2 | 在尿液樣品、標準品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。將100ul提取好的血漿樣品加入到相應(yīng)的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。 |
| 4 | 蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育120min |
| 5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 6 | 在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶聯(lián)物。 |
| 7 | 蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育60min |
| 8 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 9 | 如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時間間隔應(yīng)當相同，使用自動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
| 10 | 在每一微孔中加入200ul底物液。 |
| 11 | 在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育40min |
| 12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
| 13 | 加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm） |
| 注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
| 注意 | 試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。 |
| 樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
| 血漿 | 多巴胺濃度高于zui高標準品中多巴胺的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
| 尿液 | 多巴胺濃度高于zui高標準品中多巴胺的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
| 1） | 將標準品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各30μL和750μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入750μL雙蒸水以消除體積差別。 |
| 2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
| 3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應(yīng)該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
| 6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL?；噭?，立即混合均勻。 |
| 9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板） |
| 10） | 快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
| 12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結(jié)果。 |
| 13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干。 |
| 14） | 每孔加入450μL Release緩沖液。 |
| 15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板） |
| 稀釋 | 成分 | | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩(wěn)定性 |
| 25ml | 洗滌液 | 450ml | 雙蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
| 150μL | 酶聯(lián)物 | 15ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1:101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生 | 18-25℃ | 5h |
| 4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
11.1 COMT酶溶液的準備
| 注意：COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時配置 |
| 在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個月。
在使用自動方法做實驗時，我們建議按1：10的比例預先稀釋提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品（如果是手動操作則用Release緩沖液進行稀釋）。如果稀釋了，第二個步驟可簡化為：將已提取好的血漿樣品、已提取好的標準品（按1：10的比例預先稀釋）、質(zhì)控品和尿液樣品各100μL加入到微孔中。在進行預稀釋時，應(yīng)當考慮到自動操作的死容積。
1） 在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。
2） 在尿液樣品、標準品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。
3） 每孔中加入50μL多巴胺抗血清。
4） 蓋板。在振蕩器（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育120min
5） 棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
6） 每孔加入100μL酶聯(lián)物
7） 蓋板。在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育60min
8） 棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
9） 加底物液和終止液時，其時間間隔應(yīng)相同
10） 每孔加入200μL底物液
11） 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育40min。如果自動操作時的溫度超過25℃時，則應(yīng)相應(yīng)的將溫育時間縮短至30min。
12） 每孔加入50μL PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振蕩包被板以充分混合試劑成分。
13） 加終止液后60min之內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm）
| | 尿液 | 血漿 | ||
| μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
| 多巴胺 | ＜600 | ＜3917 | ＜100 | ＜0.65 |
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