組胺ELISA Kit
（德國IBL：RE59221）
1、應(yīng)用范圍
此試劑盒可用于人血漿和尿液中組胺的體外定量檢測。深化此實驗可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。
2、前言說明
組胺（β-咪唑乙胺）是人體中zui重要的介質(zhì)，它主要存在于過敏反應(yīng)的起始階段（速發(fā)型過敏）。組胺是由組胺酸經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生的。組胺幾乎存在于機體的所有組織中，主要儲存于柱狀細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的異染性顆粒中。組胺通常都是以無活性的復(fù)合體性存在，只有當(dāng)需要的時候才會釋放。像其它的介質(zhì)一樣，組胺不僅能調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)的各種臨床癥狀，也可以調(diào)節(jié)終止過敏反應(yīng)的一系列效應(yīng)。組胺在組織中的生物活性是通過三種受體來完成的，它們分別是H1，H2和H3受體。臨床檢測組胺的方法有：定量檢測各種速發(fā)型過敏反應(yīng)中嗜堿性白細(xì)胞釋放組胺的量，也可以檢測過敏藥物治療后各種體液（血漿，尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清）中組胺的量。
3、實驗原理
此ELISA試劑盒利用的是競爭法的原理。樣品中未知量的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭性結(jié)合到包被在微孔中的抗體結(jié)合位點上。溫育后洗板以終止競爭反應(yīng)。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強度與樣品中抗原的量成反比。樣品的實驗結(jié)果可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。
4、儲存與穩(wěn)定性
試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運輸和儲存，避免太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。如果將包被板密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下時，試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。
5、樣品的采集與儲存
血漿（EDTA，肝素）
| 按照靜脈穿刺的常規(guī)注意事項采集樣品，血液樣品自采集到實驗時都必須保證其化學(xué)完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品?；鞚岬臉悠窇?yīng)當(dāng)在實驗開始前離心以除去所有的顆粒性物質(zhì)。 | ||||
| 儲存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太陽直射，避免反復(fù)凍融。 |
| 穩(wěn)定性 | 5小時 | 3個月 | 2年 | |
尿液
| 實驗必須使用自然產(chǎn)生的尿液，也可使用24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液。收集病人24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液，并混合于含10-15ml 6N HCl防腐劑的容器中。為了計算結(jié)果，請確定尿液的總體積。實驗開始前請先將樣品離心。 | ||||
|
| 自然的尿液 | 酸化尿液 |
| 避免太陽直射，避免反復(fù)凍融。 |
| 儲存 | 2-8℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ | |
| 穩(wěn)定性 | 8小時 | 3天 | 6個月 | |
細(xì)胞培養(yǎng)上清
| 使用細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般沒特殊注意事項 細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的組胺濃度可能稍微要高些。 |
全血
| 全血中組胺釋放量的檢測必須用肝素化全血，具體信息請見相應(yīng)的說明書（RE95000） |
6、試劑盒成分
注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分
| 數(shù)量 | 標(biāo)記 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
| 1×5ml | ANTISERUM | 組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞 |
| 1×75ul | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物，200倍濃縮，內(nèi)含辣根過氧酶標(biāo)記的組胺。 |
| 7×0.4ml | CAL P A-G LYO | 血漿標(biāo)準(zhǔn)品A-G，凍干，用于血漿樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺、人血漿。具體濃度請見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。 |
| 2×0.4ml | CONTROL P1+2 LYO | 血漿質(zhì)控1+2，凍干，內(nèi)含：組胺、人血清。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽。 |
| 1×2.0ml 5×0.25ml | CAL U/C A-F | 尿液/細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)品A-F，0;2.7;8.1;24.3;73;219ng/ml,即用，用于尿液和細(xì)胞培養(yǎng)樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺和0.1M的HCl。 |
| 2×0.25ml | CONTROL U/C 1+2 | 尿液質(zhì)控1+2，即用，內(nèi)含：組胺、人尿液（酸化的）。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽。 |
| 1×2.25ml | ACYLREAG | ?；噭?，即用，內(nèi)含：DMF |
| 1×60ml | ASSAYBUF CONC | 檢測緩沖液，5倍濃縮，內(nèi)含Tris緩沖液、吐溫、BSA和0.05%的硫柳汞。 |
| 1×50ml | WASHBUF CONC | 洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×10ml | INDICATORBUF | 指示緩沖液，紫色，即用，內(nèi)含：Tris緩沖液、苯酚（pH＜7.5時顏色會發(fā)生改變＝和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×12ml | TMB SUBS | TMB底物液，即用，內(nèi)含TMB、緩沖液和穩(wěn)定劑。 |
| 1×12ml | TMB STOP | TMB終止液，即用，1M的H2SO4。 |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
7、實驗所需器材但試劑盒不提供
1）移液器，體積：10;20;50;100;1000ul
2）試管（12×75mm）
3）試管架
4）振蕩器
5）旋渦混合器（500rpm）
6）帶儲器的8道移液器
7）洗滌瓶，自動或半自動洗板機
8）酶標(biāo)儀（參考波長：600-650nm）
9）蒸餾水或去離子水
10） 吸水紙、取樣吸頭和計時器
8、實驗前的準(zhǔn)備說明
| 注意 | 96人份的試劑盒可分成三份分別進行檢測，下述體積為檢測32人份時所需要的體積。 |
8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備
| 稀釋/溶解 | 成分 |
| 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲存 | 穩(wěn)定性 |
| 20ml | 檢測緩沖液 | 100ml | 蒸餾水 | 1：5 |
| 2-8℃ | 2周 |
| 15ml | 洗滌液 | 300ml | 蒸餾水 | 1：20 | 18-25℃將晶體溶解掉 | 2-8℃ | 4周 |
|
| 血漿標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.4ml | 蒸餾水 |
| 靜置15min,混合時無泡沫 | -20℃ | 1個月 |
|
| 血漿質(zhì)控品 | 0.4ml | 蒸餾水 |
| 靜置15min,混合時無泡沫 | -20℃ | 1個月 |
| 10ul（*） | 酶聯(lián)物 | 2ml | 檢測緩 沖液 | 1:200 | 臨時配置,只能使用一次 | 18-25 ℃ | 30分鐘 |
（*）在稀釋前,確保塞子內(nèi)無殘留液體.
8.2樣品的稀釋
樣品中組胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品,應(yīng)當(dāng)在?；坝孟鄳?yīng)的稀釋液稀釋,尿液樣品用0.1M的HCl,血漿樣品用樣品稀釋液（Cat.no. KEHP711）,試劑盒內(nèi)未提供。
8.3樣品的?；?/span>
用試管準(zhǔn)備樣品
| 注意 | 不能血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線確定?；蛞夯蚣?xì)胞培養(yǎng)樣品中組胺的濃度,也不能用U/C標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酰化血漿樣品中組胺的濃度. |
8.3.1血漿
| 1 | 將血漿標(biāo)準(zhǔn)品、血漿質(zhì)控品和病人樣品分別100ul加入到相應(yīng)的試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入100ul指示緩沖液，旋渦混合。 |
| 3 | 在每一試管中加入20ul?；噭?，加入?；噭┖罅⒓葱郎u混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入750ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
8.3.2尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清
| 1 | 將U/C標(biāo)準(zhǔn)品、尿液質(zhì)控品和病人尿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清分別50ul加入到相應(yīng)的試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入50ul指示緩沖液，旋渦混合。如果指示劑變成無色，說明溶液的pH值很低，樣品中含有很多酸性物質(zhì)。在這種情況下，再向試管中加入50ul指示緩沖液直至溶液略帶微紅。 |
| 3 | 在每一試管中加入10ul?；噭?，加入酰化試劑后立即旋渦混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入2000ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
注意：酰化處理好的樣品可在2-8℃下存放一晚，-20℃環(huán)境下可存放2天。
9、實驗步驟
| 1 | 將?；幚磉^的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul臨時配置好的酶聯(lián)物。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul組胺抗血清。 |
| 4 | 蓋板，振蕩器（500rpm）上室溫溫育3小時。 |
| 5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 6 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔的時間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
| 7 | 在每一微孔中加入100ul TMB底物液。 |
| 8 | 血漿：振蕩器（500rpm）上室溫溫育40min。 尿液/細(xì)胞培養(yǎng)上清：振蕩器（500rpm）上室溫溫育20min。 |
| 9 | 在每一微孔中加入100ul TMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕振板使溶液混合均勻。 |
| 10 | 加終止液后15min內(nèi)450nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm） |
10、期望值
實驗結(jié)果不能當(dāng)作任何治療結(jié)果的*原因，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍：
| 血漿 | 尿液 | |
|
| 24小時尿液 | 自然產(chǎn)生的尿液 |
| ng/ml | ug/d | ug/g肌酐酸 |
| 0.2-1.0 | 5-56 | 8-53 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
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